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細胞轉染實驗解決方案

發布日期:2015年10月14日   瀏覽次數28132

  要通過克隆化基因生產名副其實的真核生物活性蛋白,往往需要進行翻譯后加工,像二硫鍵的形成、糖基化、磷酸化等等。受到自然界原核生物經常分享遺傳物質的啟發,人們開始將一些外源分子如DNA、RNA、蛋白等分子導入真核細胞中,細胞轉染技術應運而生,尤其在研究基因功能、基因治療、基因表達調控的時候會經常使用此技術。
  細胞轉染技術又分瞬時轉染和穩定轉染,這是根據具體的實驗目的來決定的。轉染方法中最常用的是陽離子脂質體方法,它的適用性廣,適于所有細胞的穩定轉染或瞬時轉染,轉染效率高,重復性好,操作簡單方便。但是不同的細胞,轉染效果差別很大,這與轉染試劑的特性有關。所以選擇一款合適的轉染試劑對實驗的成敗非常關鍵。
  天根公司目前有三款轉染試劑(Lipofect,DNAfectin,RNAfectin),均為陽離子脂質體轉染試劑,可對多種類型的細胞達到較高的轉染效率,在優化條件下將陽離子脂質體試劑加入水中時,它可以形成微小的(平均大小約100-400nm)單層脂質體。這些脂質體帶正電,可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面,從而將俘獲的DNA導入培養的細胞。


Lipofect轉染試劑(RM201)
★ 既可用作DNA轉染,也可用作RNA轉染
★ 可在血清存在的情況下進行轉染,轉染后無需除去轉染試劑
★ 操作簡單快速
★ 轉染效率穩定高效

應用過的細胞類型

 

DNAfectin轉染試劑 (RM202)

★ 適用于將DNA轉染入真核細胞
★ 獨特的DNA專用配方使復合體的形成更高效
★ 更易于復合體結合到細胞膜表面
★ 毒性更低,轉染效率更高
★ 對大多數細胞都可高效轉染

 

RNAfectin轉染試劑 (RM203)

★ 適用于將RNA轉染入真核細胞
★ 獨特的RNA專用配方使復合體的形成更高效
★ 更易于復合體結合到細胞膜表面
★ 毒性更低,轉染效率更高
★ 對大多數細胞都可高效轉染

 

實驗注意事項


轉染實驗的成敗與眾多因素的影響有關,包括細胞狀態、血清選擇、抗生素的加入、啟動子的選擇、核酸的質量、復合物的形成比例、試劑保存等等。
1)細胞狀態:建議傳代細胞傳到第三代左右時就進行轉染,取對數生長期狀態良好的細胞。貼壁細胞的細胞鋪板密度建議在70-90%,懸浮細胞鋪板密度在2×106-4×106/ml。根據細胞類型和培養基類型,選擇合適的穩定的培養溫度、濕度和CO2濃度,整個實驗過程需要嚴格的無菌操作,防止細菌、支原體、真菌等的污染。
2)血清選擇:選擇質量穩定的血清,在稀釋質粒和轉染試劑時要用無血清的培養基稀釋,否則會影響復合物形成的效率,從而影響轉染效率。盡量在無血清條件下進行轉染,轉染效率會比較高。轉染后換成新鮮的培養基進行細胞培養,可以有效提供細胞的存活率。
3)抗生素的加入:在轉染培養基、細胞鋪板培養基、穩定轉染時的選擇性培養基中避免使用抗生素,因為這些抗生素會降低轉染效率。
4)啟動子的選擇:對于穩定轉染最好選擇誘導型啟動子,對于瞬時轉染可選擇組成型啟動子。

5)核酸的質量:核酸的純度直接影響到轉染的效率。建議在質粒轉染的時候,盡量用高純的質粒提取試劑盒。尤其是轉染原代細胞、懸浮細胞等難轉染的細胞,甚至要用無內毒素的質粒提取試劑盒。建議提取質粒的濃度最好是1ug/ul,至少在500ng/ul以上。
6)復合物的形成比例:第一次實驗時一定要做一個梯度實驗摸索合適的核酸與轉染試劑的比例。一般說明書上會有一個建議值范圍,但那主要是針對常規細胞種類的實驗建議值。由于細胞種類很多,轉染的難易程度也不一樣,為了確保轉染效率,希望針對自己的細胞類型做好梯度條件的摸索。每款試劑本身的配方特點有所差異,即使是一種細胞,用不同轉染試劑轉染時,這個比例還需要再做略微的調整。
7)試劑保存:轉染試劑必須在4度保存,無論是從送貨員手中接到貨品,還是在整個實驗過程中必須在4度條件保存試劑,否則轉染效率會受到很大的影響。

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